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细胞的原代培养实验

浏览次数:103发布日期:2020-09-26
实验方法原理

原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养,由于细胞刚刚从活体组织分离出来,故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段,同时也为以后传代培养创造条件。最用的原代培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上,加入培养基后进行培养。分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细胞分散。从胎儿或新生儿的组织分离到活性好的游离细胞,经典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和胶原酶)消化细胞间的结合物,或用金属离子螯合剂(如EDTA)除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+,再经机械轻度振荡,使之成为单细胞。

实验材料

孕鼠(胚胎小鼠) 新生1~3天乳鼠

试剂、试剂盒

1640培养液 PBS 胰蛋白酶 EDTA混合消化液 乙醇

仪器、耗材

手术器械 平皿 培养瓶 吸管 离心管 煤气灯 烧杯 超净工作台 二氧化碳培养箱 倒置显微镜

实验步骤

1.  取材
 

用颈椎脱位法使胎大鼠迅速死亡。然后,把整个动物浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒,取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤,剖腹取出肝脏或肾脏,置于无菌平皿中。

 

2.  切割
 

用灭菌的PBS 液将取出的脏器清洗三次,然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎,直到成1 mm左右的小块,再用PBS 清洗,洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中,静置数分钟,使组织块自然沉淀到管底,弃去上清。

 

3.  消化、接种培养
 

吸取0.25%胰蛋白酶一0.02%EDTA 混合消化液1 ml,加入离心管中,与组织块混匀后,加上管口塞子,37 ℃水浴中消化8~10 分钟,每隔几分钟摇动一下试管,使组织与消化液充分接触,静止,吸去上清,向离心管中加入5~10 ml 含10%小牛血清的1640 培养基,用吸管吹打混匀,移入二个培养瓶中,置于二氧化碳培养箱中培养。

注意事项

1. 严格进行动物皮肤消毒.使用三套器械取材。新生动物皮肤先用2%碘酊液消毒,成年鼠先用3%~5%碘酊液消毒后用75%乙醇消毒。

 

2. 严格进行无菌操作,防止细菌、真菌、支原体污染,避免化学物质污染。

 

3. 吸取液体前,瓶口和吸管进行火焰消毒;经火焰消毒后的吸管一定要用Hank’S液冷却。防止烫伤、烫死细胞。吸取液体时,避免瓶口和吸管接触碰撞。

 

4. 离心管入台前,管口、管壁应消毒。

其他来源《中国医科大学实验指导手册》《分子生物学实验指导》
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